研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是一种不可治愈的高度异质性脑肿瘤，起源于人类神经干细胞/祖细胞(hNSCs/hNPC)。尽管在scRNA-seq与bulkRNA-seq水平上对hNSCs和终末期GBM进行了广泛的研究，但由于早期采样和临床前建模的技术困难，来自hNSCs的神经胶质瘤新生路径在很大程度上尚不清楚。
作者建立了两个高度渗透的hNSC来源的恶性胶质瘤模型，类似于人GBM的组织病理学和转录异质性。结合全外显子组测序、scRNA-seq与bulkRNA-seq的拟时间序列分析，重建了胶质瘤的生成轨迹。该研究结果揭示了之前未被充分描述的分子动力学和命运选择驱动hNSCs新生胶质瘤的形成，为潜在GBM的早期治疗/诊断提供了蓝图。
方法流程
研究结果
1、GBM相关肿瘤抑制基因突变的基因编辑hNSCs可产生高外显率的恶性胶质瘤
作者从Hues8-iCas9人多能干细胞(hPSCs)中生成iCas9hNSCs，设计两种靶向TP53、NF1或PTEN的gRNAs组合，靶向TP53/NF1/PTEN(TNP)或TP53/NF1(TN)的gRNAs在携带mCherry基因的慢病*载体V2TC中被导入iCas9hNSCs(图1a)。将载体TN和TNPhNSCs原位移植到免疫缺陷NOD/SCID小鼠的大脑中,所有载体小鼠均未发生脑肿瘤(0/16)。相比之下，%的TN(15/15)和TNP(14/14)小鼠发生了脑瘤(图1b、c)。在宏观水平上，TNP肿瘤始终可见，TN肿瘤不可见，TN和TNP高级别胶质（HGG）均表现出广泛的肿瘤浸润，侵犯移植部位同侧和对侧的大脑区域。TN和TNP肿瘤表达了高水平的胶质瘤标志物GFAP,hNES,Ki67和pERK，转录因子OLIG2TN在TN和TNP肿瘤也高度表达(图1e,f)。
结果表明，带有GBM相关抑癌基因突变的基因组编辑hNSCs可产生高外显率的恶性胶质瘤，这与人类GBM的病理特征相似。
图1TN和TNPhNSCs在体内产生高外显率的HGGs
2、TN和TNP肿瘤类似于GBM肿瘤间和肿瘤内的异质性
作者为了研究TN和TNP肿瘤是否在转录上模仿人类GBM，在6个TN和11个TNPHGG中进行bulkRNA-seq，将测序结果与TCGA数据库的RNA-seq进行比较。TN和TNP肿瘤在GBM/TCGA数据库中均被分类为低度神经胶质瘤（LGG）。为了进一步确定其分子亚型，使用了已发表的基于单样本基因集富集分析（ssGSEA）的策略，TN和TNP肿瘤均表现出显著的肿瘤间异质性，代表了所有三种TCGA亚型（图2f）。为了确定这些肿瘤是否还表现出肿瘤内异质性，对两个TNP肿瘤（＃4和＃6）及其与肿瘤相关的SVZ（脑室下区）进行了配对的scRNA-seq。与先前的报道一致，单个TNP肿瘤细胞表达了不同的亚型特征（图2f）。
结果表明，具有明确起始突变的基因组编辑hNSCs可导致恶性胶质瘤，具有肿瘤间和肿瘤内的异质性，在整体和单细胞水平上转录类似于人类胶质母细胞瘤。
图2TN和TNP肿瘤在组织学和转录上与人类GBM相似
3、“致癌性爆发”阶段将新生肿瘤与正常分化细胞区分开来
作者为重建hNSC到恶性胶质瘤的成瘤路径，在肿瘤进程中的四个时间点（T0：起始TNPhNSC细胞；T1：移植后一月；T2：移植后2月；End/End_SVZ:终末肿瘤和肿瘤浸润的SVZ区）进行多个体取样用于全外显子组、bulk转录组和单细胞转录组测序，并在平行时间点收集了对照hNSC移植组数据（图3a）。
结果表明,T2是两条轨迹的重要分支点，大量胶质瘤相关基因在此时间点爆发式差异表达(图3b-e)。组织切片染色也表明，T2期TNP细胞虽未形成终末期肿瘤，却相较T1期表现出更为明显的恶性特征（图3f），T2是肿瘤发生过程中的重要阶段。
图3T2是肿瘤发生与正常分化的重要阶段
4、新生胶质瘤的形成是由NSC样细胞的连续命运转变驱动的
作者进一步通过单细胞转录组分析构建了肿瘤发生树，发现了一群在肿瘤进程中持续存在、保持增殖的NSC-like细胞亚群（如图4b-d）。这些细胞在肿瘤发生树的分布提示其在成瘤过程中发生了多次命运改变，分时、依序产生神经元样（Neuron-like）、星形胶质细胞样（AC-like）和少突胶质细胞样（OC-like）细胞(图5c-e)。
结果表明三个时间段的BrdU体内谱系追踪实验证实了NSC样细胞的存在及其命运转变。神经胶质瘤发生过程中NSC样细胞的命运开关似乎并不依赖于TNP基因型。
图4时间序列scRNA-seq揭示了不同细胞谱系的时间动态
图5重构的胶质瘤发生树突出了NSC样细胞的命运开关
5、胶质瘤形成轨迹突出了阶段特异性的TF网络，并为早期干预提供了蓝图
作者通过Pseudotime拟时序分析追踪了NSC-like细胞在成瘤过程中的分子演进，发现了时间点特异的肿瘤发生调控网络和一系列新的潜在促瘤因子如C1QL1，并通过体外细胞实验和体内成瘤实验证明过表达C1QL1可以促进肿瘤形成(图6d-f)。作者进一步针对NSC-like细胞成瘤过程中持续上调的AP-1基因，使用一种已进入临床二期的特异性靶向抑制剂T，在三个时间点对小鼠进行预防性给药10天，发现早期而非后期短时程靶向干预可以有效的抑制胶质瘤发生并显著延长小鼠生存期，证明存在潜在的早期诊疗时间窗口(图7)。
图6伪时间分析识别阶段特定的调节程序
图7短暂的早期AP-1抑制阻碍体内胶质瘤发生
结论
1.该研究开发了两种类似于人类胶质母细胞瘤的高渗透性恶性胶质瘤模型；
2.重建了胶质瘤的生成轨迹，并在肿瘤发生的所有阶段鉴定了一个NSC样群体，发现NSC样细胞中的多步转录重编程和命运转变驱动肿瘤的发生；
3.证实了C1QL1是一种新的胶质瘤促进因子；
4.在神经胶质瘤发生的早期靶向核心TFs如AP-1可能会破坏NSC样细胞的致瘤轨迹。该研究结果为潜在的GBM早期治疗/诊断提供了宝贵的资源和蓝图。
参考文献
XiaofeiWang,RanZhouetal.().Sequentialfate-switchesinstem-likecellsdrivethetumorigenictrajectoryfromhumanneuralstemcellstomalignantglioma.CellResearch()0:1–19
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